革兰氏染色

革兰氏染色原理：

       革兰氏染色法是微生物学中广泛使用的一种鉴别染色法，可用来区分革兰氏阳性菌（G+）和革兰氏阴性菌（G-），基本原理是基于细菌细胞壁化学组分不同。细菌经结晶紫初染和碘液媒染后，在细胞壁内形成不溶于水的结晶紫-碘复合物。革兰氏阳性细菌由于细胞壁较厚，不含类脂，富含肽聚糖并交联形成致密网格结构，在用乙醇处理时肽聚糖网孔收缩，能将结晶紫-碘复合物阻留在细胞壁内，使其呈现结晶紫的紫色。而革兰氏阴性细菌因其细胞壁薄，肽聚糖含量低且交联松散。遇乙醇时富含类脂的外膜溶解，在细胞壁上出现较大缝隙，结晶紫-碘复合物流出，因此经乙醇脱色后细胞又成无色。此时再经番红复染，革兰氏阴性细菌将被染成红色。

染色步骤：

革兰氏染色法一般包括初染、煤染、脱色、复染等四个步骤，具体操作方法是：

1、石蜡切片脱蜡至水；细菌涂片自然干燥或酒精灯略加温干燥固定。

2、 初染：滴加结晶紫染色液覆盖样本染色10-30 s，水洗，甩干水分。

3、 媒染：滴加1%碘溶液覆盖样本染色1-1.5 min，水洗，甩干水分。

4、 脱色：滴加脱色液从载玻片一端冲洗组织进行脱色，直至流下的脱色液不再出现紫色为止，立即水洗去除脱色液。注意控制脱色时间。

5、 复染：滴加复红染色液染色20-60 s，水洗。用滤纸吸干边缘水分。

6、 细菌涂片可直接镜检观察。组织切片经60℃烤干后，经无水乙醇快速脱水三次，分别1 s、3 s、5 s。然后经二甲苯透明5 min，最后以中性树胶封片，镜检。

染色结果：革兰氏阴性菌呈红色，革兰氏阳性菌呈紫色至蓝紫色。以均匀分散开的细菌的革兰氏染色反应为准，过于密集的细菌，常常呈现假阳性。

注意：革兰氏染色的关键在于严格掌握脱色程度，如脱色过度，则阳性菌可被误染为阴性菌；而脱色不够时，阴性菌可被误染为阳性菌。此外，菌龄也影响染色结果，如阳性菌培养时间过长，或已死亡及部分菌体自行溶解，都常呈阴性反应。