免疫组化

免疫组化：

是应用免疫学基本原理——抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究，称为免疫组织化学技术(immunohistochemistry)或免疫细胞化学技术(immunocytochemistry)。

实验流程：

切片—脱蜡至水—抗原修复—灭活—封闭—一抗孵育—二抗孵育—显色—复染—封片

1， 切片：切片厚度4微米，42°C水温展片，60°C烘箱烤片30分钟。   注意：对于骨或皮肤易脱片的组织，可适当延长烤片时间。

2， 脱蜡至水：二甲苯Ⅰ5分钟，二甲苯Ⅱ5分钟，二甲苯Ⅲ5分钟，无水乙醇1分钟，95%乙醇1分钟，75%乙醇1分钟，蒸馏水洗5分钟。   注意：具体时间需要根据室温盒二甲苯的新旧程度灵活调整，室温越高，二甲苯越新，相应时间越短，以组织上无状石蜡残留为准。

3， 抗原修复：EDTA微波热修复5-8分钟，冷却至室温。      注意 ：对于大部分蛋白来说，EDTA修复液一般都能得到满意的结果，也可使用胰酶法修复液或传统的柠檬酸盐修复液，样本固定时间过久或者阳性表达不强，可适当增加修复的次数和强度。

4，  灭活：免疫组化笔画圈，防止试剂流出，滴加内源性过氧化物酶阻断液，室温孵育10分钟，PBS缓冲液洗3次，每次5分钟。     注意：对于内源性过氧化物酶含量高的组织，可以适当延长孵育时间或增加过氧化氢浓度。

5， 封闭：滴加封闭血清37℃孵育30分钟，甩去多余血清，勿洗。

6， 一抗孵育：滴加一抗，37℃湿盒孵育2h，PBS缓冲液清洗3次，每次5分钟。      注意：初次实验，建议一抗做浓度梯度，以确定最佳的一抗稀释比例。

7， 二抗孵育：滴加HRP标记羊抗兔，37℃孵育30分钟，PBS缓冲液清洗3次，每次5分钟。      注意：根据一抗种属决定二抗的类型，比如一抗为兔抗，那二抗选择HRP标记的羊抗兔lgG。

8， 显色：DAB显色液，配置DAB：1mlB液+1滴A液混匀，滴加DAB显色液，镜下观察至阳性明显增强、背景干净终止显色；如果显色淡，可重复上一步增强显示色。

9， 复染：滴加Mayer︐S苏木素30s，蒸馏水洗，返蓝液漫泡1分钟，水洗。

    10，脱水透明封片：75%-95%-100%酒精梯度脱水，每缸1分钟，二甲苯透明三缸，每缸2分钟，中性树胶封片。

    结果：阳性部位棕褐色，细胞核天蓝色，对比鲜明，无背景着色。